中外研究登上自然封面：这种蛋白让知更鸟能用地磁导航

欧洲知更鸟（European Robin）是一种极佳的研究对象，这种夜行性迁徙鸟类此前被证明具备地磁导航能力，它们可以利用强度弱到0.5高斯左右的地磁场进行长距离定向，以完成年复一年的季节性迁徙。

然而背后的机制是什么？对于这个问题，需要一场高度跨学科的配合才能解答一二。北京时间6月23日23时，顶级学术期刊《自然》（Nature）以封面形式在线发表了由德国奥尔登堡大学、英国牛津大学、中国科学院合肥物质科学研究院、美国普渡大学、得克萨斯大学西南医学中心、德国弗莱堡大学等多个团队的科学家联合完成在一项重磅研究，题为“Magnetic sensitivity of cryptochrome 4 from a migratory songbird”。研究证明了鸟类视网膜中的隐花色素蛋白（Cry4）对磁场很敏感，很可能就是长期寻找的磁传感器。

该研究的通讯作者共有6位，其中一位是来自中国科学院合肥物质科学研究院强磁场科学中心的谢灿研究员，强磁场科学中心为共同通讯单位。谢灿实验室与奥尔登堡大学团队一起，首次在实验室成功制备获得了具有生物活性的夜间迁徙鸟类欧洲知更鸟的Cry蛋白，为整项研究的成功奠定了基础。

谢灿在接受澎湃新闻（www.thepaper.cn）记者采访时表示，这场始于2016年的多方合作仅仅是各实验室关于生物磁感应研究的第一阶段，“这篇文章也是我们长期合作的第一个阶段性的成果。”未来仍有大量的工作需要其实验室和合作方共同探索。

谢灿于2001毕业于中国科学院遗传与发育生物学研究所，获理学博士学位。同年8月赴美，在哈佛大学医学院Timothy Springer实验室从事分子生物物理学和结构生物学研究。2009年至2019年在北京大学生命科学学院任教授，2019年11月应邀加盟并调入中国科学院强磁场科学中心任研究员至今。2020年12月共同创建“国际磁生物学前沿研究中心”（International Magnetobiology Frontier Research Center (iMFRC)）。

值得一提的是，此前的2016年，谢灿实验室在国际学术期刊《自然-材料》（Nature Materials）发表了其在动物磁感应和生物导航领域的原创性突破，在国际上首次发现了动物对磁场感知的磁受体基因，该基因编码的磁感应蛋白（MagR）具备內禀磁性，能和Cry蛋白形成复合物，进而识别外界磁场并做出响应。据此，谢灿提出了动物感磁的“生物指南针”假说。该工作被评为“2015年度中国生命科学领域十大进展”。

牛津大学化学系物理与理论化学实验室的Peter Hore教授也是这项最新研究的通讯作者。Hore是生物磁感应假说主要流派之一，即依赖隐花色素的化学自由基对模型（radical-pair）的主要贡献者，他在回复澎湃新闻（www.thepaper.cn）记者采访的邮件中写道，“如果我们能证明Cry4是磁感受分子，我们也就证明一个根本性的量子机制，它使得动物能感知极其微弱的环境刺激，这个刺激的强度比以前认为的要弱一百万倍”。

提及上述化学自由基对假说，时间要拨回到1978年。彼时，德国化学家Klaus Schulten等人提出初步模型，将量子纠缠引入这一研究领域，认为鸟类的磁感应机制涉及自由基对的纠缠态。Schulten团队最终于2000年发表了研究成果, 指出隐花色素很可能就是鸟类磁导航过程中的关键分子, 并大胆推测了感磁过程。

其后经过近20年的发展，该假说的轮廓日渐清晰：首先是隐花色素中的光敏色素辅基FAD吸收一个蓝光光子的能量, 并由此引起FAD基团电子的跃迁, 留下一个空轨道; 然后从临近的四个色氨酸上依次夺取电子，这就是“电子转移”，此时这对被分离的电子由于量子纠缠同时具有自旋单态和三重态; 最后, 两种状态的微妙平衡可由地磁场的方向决定, 并通过某种方式将此信息传递给大脑, 使生物体可以对地磁信息作出响应。

研究团队从物理学、化学和生物学等多方面系统且完整地总结了自由基对假说的基本原理和支撑证据。

相比于此前的理论研究，此次这项多方合作的研究以欧洲知更鸟的隐花色素4蛋白为主要研究对象，开展了一系列高精度的光谱学测试，并进行计算生物学模拟，实现了理论和实验的相互验证。这是首次对夜行性候鸟隐花色素蛋白中自由基光化学磁敏特性的全面阐释，证实并完善了自由基对磁感应机制，对深入解释候鸟地磁定向行为提供了重要依据。

来自迁徙鸟类的功能性Cry4蛋白

早在2000年，科学家通过理论计算，提出光敏蛋白隐花色素（Cry）是一种可能的磁感应蛋白。理论上，在蓝光条件下，外部磁场信息可以转化为隐花色素蛋白中的光致自由基对量子产率变化，从而被细胞感知。

隐花色素蛋白为何被科学家认为是动物磁感应分子？该论文的第一作者、来自奥尔登堡大学的许静静对澎湃新闻（www.thepaper.cn）记者解释道，隐花色素蛋白能够结合黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)，又名活性型维生素B2，FAD受蓝光激发后发生还原反应，可依次夺取其附近色氨酸（Trp）的电子，从而形成具有磁敏性的自由基对[FAD·- TrpH·+]。

“可以说，FAD是这个磁敏分子的‘心脏’，只有结合了辅因子FAD的隐花色素蛋白，才具备磁敏性的先决条件。”许静静现为奥尔登堡大学Henrik Mouritsen实验室的博士生，在赴德国留学之前，许静静在中国科学院电工研究所完成了硕士学习，并在谢灿教授实验室接受了生物化学技术训练。。

值得一提的是，自由基对磁感应假说自1978年提出后迟迟未能在鸟类中被实验证实的原因之一，即重组表达的鸟类隐花色素蛋白往往因为蛋白质的错误折叠而失去其本身的功能，对隐花色素来说就是丧失了关键辅基FAD。

“自由基对假说此前的最大的遗憾是，科学家从未能在迁徙鸟类中获得隐花色素蛋白的磁敏感性的实验证据。早期的尝试中曾经有实验室用植物或者非迁徙动物的隐花色素蛋白做过一些实验，但作为最典型的迁徙动物，候鸟，受限于鸟类隐花色素蛋白的纯化难度，从来没有真正被研究过。”谢灿补充道。

在这项研究中，科学家们终于获得了有功能的、结合FAD的迁徙鸟类隐花色素蛋白。在谢灿和Mouritsen的指导下，许静静利用实验室定制优化后的Cold-Shock蛋白表达系统，表达并纯化了具有生物活性的夜间迁徙鸟类Cry4蛋白。该蛋白质样品因FAD发色团的存在而呈现出美丽透明的黄绿色，质谱分析显示该蛋白的FAD结合率高达97%。为整项研究的成功奠定了基础。

欧洲知更鸟Cry4蛋白的获得实际上颇为曲折。谢灿对澎湃新闻记者表示，早在合作之初，也就是2016年4月，原计划是由谢灿实验室在国内制备蛋白，然后通过航空运输送往国外的合作团队进行下一步测试试验。

在此前关于MagR的研究中，谢灿已成功表达纯化了信鸽（能定向归巢，但非季节性迁徙鸟类）的MagR和Cry蛋白，以及两种蛋白的复合物。

但国际运输方案并不可行。谢灿清晰地记得，2016年的6月9日，其实验室第一次往英国牛津大学寄送样品进行实验，但举步维艰。“长途国际运输蛋白质样品需要将蛋白首先冷冻保存，然后到达目的地的实验室之后再解冻。当时发现一个问题，无论是 Cry蛋白，还有我们自己发现的MagR蛋白，或者是两者的复合物，所有这些跟磁感应相关的蛋白都非常的不稳定，而且对温度极度敏感，在冻融的过程中蛋白质的活性大大降低乃至消失。”对于此次研究中Cry4蛋白来说，经历了长途运输和冻融过程后，关键的FAD辅基从Cry4蛋白中解离出来，Cry4蛋白也丧失了活性。

在当时的情况下，Cry蛋白质如何“保鲜”是亟待解决的问题。恰好此时，许静静在申请Mouritsen实验室的访问学者。2016年11月，Mouritsen提出一个建议，让许静静直接进入谢灿实验室，学习整套蛋白表达纯化的技术。在合作的框架下，谢灿是非常开放的，“这样对我们来说也是一个好事情，因为本身我们发表的文章也希望别人能够重复。”2个多月的高强度“速成班”后，许静静进入Mouritsen实验室。

“花了大概七八个月的时间，许静静在Mouritsen实验室把整个系统从零开始地建立了起来，Cry4蛋白的表达纯化完美地重复出来，而且也有很好的活性。”关键的基石工作完成后，Hore和Mouritsen难掩激动，在发给谢灿的邮件中表达着他们的兴奋，也就是那一刻，三方正式确立了长期合作。“我们三个是完全不一样的背景，Hore是物理学家，所以他主要是做物理化学这一块，Mouritsen是做动物行为学和神经生物学的，我是做蛋白质研究的，所以我们三个人各有所长，正好可以互补配合。”谢灿是这样描述这一三方合作的。

在随后的2年多时间里，许静静一般会在上午完成蛋白制备，然后坐上从德国飞往英国的航班，下午抵达牛津大学后直奔实验室，和团队的成员一起测试蛋白的性能，即自由基对光化学反应的磁敏特性。谢灿有一次在访问牛津大学时“体验了半趟”，“我能够意识到那2年多时间里她基本上都是这么穿梭在两个国家的多个实验室中，实验就是这么做过来的。”谢灿表示。

首次用迁徙鸟类隐花色素蛋白实验验证自由基对假说

在这项研究的开展过程中，鉴于实验内容的复杂性，涉及到的测试也极度复杂，更多的实验室加入了进来。论文中即提到，为了研究磁场对隐花色素光化学的影响，研究团队开发并不断完善了多种光谱技术。

牛津大学的研究团队开发了一系列专门用来研究隐花色素光化学磁场效应的光谱学技术，包括瞬态吸收光谱测试（Transient absorption spectroscopies），共振腔环路衰减光谱测试（Cavity ring-down spectroscopy），宽带腔增强吸收光谱测试（broadband cavity-enhanced absorption spectroscopy）以及电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance）。Hore如此形容，“这些设备，是实验室一代又一代有才华的博士后和研究生共同努力多年以来才开发出来的。”

许静静介绍道，简单来说，研究人员将蛋白样品放置于磁场中，并用450nm蓝光照射，检测不同磁场条件下以及不同时间分辨率下，该蛋白瞬态自由基对的光吸收变化。

实验结果显示，施加磁场后，隐花色素蛋白中的自由基对产量发生了变化，即磁场效应（magnetic field effect），并且欧洲知更鸟的隐花色素蛋白比非候鸟（鸡和鸽子）的隐花色素蛋白磁场效应强10到20倍。

研究团队还阐明了这种磁敏感性产生的机理，即基于蓝光吸收引发的电子转移反应。蛋白质分子由一连串氨基酸组成： Cry4有527个氨基酸，其中的4个色氨酸对于磁敏特性至关重要。在蓝光的激发下，电子在FAD和这4个色氨酸跳跃，产生所谓的磁感应自由基对。牛津大学的Peter Hore和奥尔登堡的物理学家Ilia Solov'yov进行了量子力学计算，支持这一观点。

为了验证这一点，奥尔登堡大学的研究人员又进一步制备了隐花色素的色氨酸突变体蛋白，即电子传递链上的4个色氨酸（WA、WB、WC和WD）依次由苯丙氨酸（F）替代，后者无氧化还原活性，不能给FAD提供电子，从而切断电子传递链。

在各突变体蛋白中，电子传递链依次被为3个、2个和1个色氨酸，瞬态吸收光谱测试结果显示，突变体蛋白的自由基对寿命由微秒缩短为纳秒、皮秒级别。电子顺磁共振测试结果显示，野生型蛋白的自由基[FAD·+ TrpDH·+]相距2.2nm, 第4个色氨酸被突变以后，自由基对[FAD·+ TrpcH·+]相距1.8nm。

论文指出，该实验结果与理论模拟吻合。在野生型隐花色素蛋白中，电子依次在4个色氨酸间转移，这4步转移使得最终未配备电子相距最远，从而形成了长寿命的自由基对，后者自旋相干的超精细作用是磁场作用点。

许静静提到，令人惊讶的是，当最远端第4个色氨酸被突变之后，蛋白质的磁场效应反而比野生型蛋白更强，并且比同是三色氨酸电子传递链的拟南芥植物隐花色素的磁场效应强。

研究人员提出，为什么大自然要为鸟类隐花色素蛋白进化出第4个色氨酸，如果它的作用仅仅是降低磁场灵敏性？进一步研究显示，野生型蛋白（ErCry4）和突变体（ErCry4 WDF）在毫秒时间内的衰变动力学反应相似，并且磁场二分值（B1/2）相近。这意味着二者的磁敏性起源一致，均来自第3个色氨酸，第4个色氨酸可能并未参与动物磁感应过程。

那么这第4个色氨酸介导的电子传递究竟发挥什么作用呢？Ilia Solov’yov课题组与Hore课题组通过自旋动力模拟，并基于上述实验结果，提出了自由对动态平衡机制，即电子在第3和第4色氨酸之间可能来回跳跃，由此形成的两个自由基对[FAD·- TrpCH·+]和[FAD·+ TrpDH·+]处于快速动态平衡中，并分别扮演不同的角色。

两种角色分别为：由黄素-第三色氨酸形成的自由基对主要负责磁场感知，由黄素-第四色氨酸形成的自由基对主要负责体内生化信号传导。“这一机制在以前任何物种的隐花色素蛋白中都未发现过。”谢灿表示。

研究团队预测，也许在体内还存在与隐花色素蛋白互作的其他蛋白，如谢灿此前报道过的MagR或者其他尚未鉴定的信号分子，实现信号的级联放大或者对隐花色素蛋白的定向排列，进一步增强在生物体内的磁敏感性和对方向的识别。“当然这些推测都需要未来更多的实验去证实。”

他们猜测，或许，大自然正是通过这种精巧机制，绝妙地优化了隐花色素蛋白的自由基光化学反应，实现了磁场感受并信号传导的双重功能，从而使得迁徙鸟类在跨越半球的旅程中找到方向。

谢灿向澎湃新闻记者总结道，这项研究主要取得的突破为，第一，从实验上用迁徙鸟类的隐花色素蛋白验证了自由基对假说；第二、发现迁徙鸟类的隐花色素蛋白4比非迁徙鸟类的对磁场更敏感；第三、首次发现自由基对假说中的四个保守色氨酸分别承担着磁感应和信号传递两种不同功能。

争议中前行，体内验证并非易事

值得注意的是，在动物磁感应研究领域，目前尚存在诸多争议。

谢灿表示，综合来看, 截至目前备受关注的磁感应假说主要有电磁诱导模型、磁铁矿颗粒模型、依赖隐花色素的化学自由基对模型、生物指南针模型。这些假说均有一定的实验证据支持, 同时也存在一定的局限或不足。

谢灿将动物磁感应研究称之为“很不生物学”的一项研究。类比感官生物学常规的研究思路，科学家们首先已经确定地知道某种特定感觉系统的存在, 以及是何种感觉器官, 在此基础上鉴定出该感觉系统的感受器细胞、神经通路以及大脑中与该感觉相关的区域等。

但磁感应研究截然不同。在这一领域，往往由生物学家们发现和提出了问题，但由物理学家们提出了天马行空的假说，然后化学家们也会参与进来开展大量的验证试验。此前谢灿实验室关于MagR的发现与生物指南针假说的提出也大体上遵循了这一思维范式。

尽管这项最新的研究取得了多项重要突破，但Hore强调，这并不是隐花色素就是磁传感器的确凿证据。因为“这项研究是用纯化的蛋白做的体外实验，实验中用到的磁场也远高于地磁场。” Henrik Mouritsen表示 “我们需要在鸟类的眼睛中证明这一蛋白对地磁场的敏感性，但目前的技术瓶颈并不能让我们做到这一点。”

研究团队推测，隐花色素蛋白在体内环境中可能会表现出对磁场更高的敏感性。例如，在视网膜细胞中，蛋白质可能有固定的取向而排列起来，从而增强了它们对磁场方向的敏感性。此外，它们还可能与其他蛋白相互作用，例如此前报道的磁受体MagR，甚至其他尚未被鉴定的蛋白质，以实现信号级联放大的效果。科学家们也正在寻找这些未知的“互助伙伴”。

关于该项目的未来研究计划，许静静指出，寻找隐花色素的互作蛋白和并进行体内实验验证，是两大挑战。

实际上，截至目前，即使自由基对假说的证据最为全面，但动物磁感应机制研究的多个假说均需不断发展、完善和甄别。“磁感应领域流派众多，每一个研究成果的发表，在审稿过程中都需要经受审稿人的广泛质疑和挑战，而这些审稿人常常都来自不同的学术流派，带着不同的学术观点，而且，常常还是你的竞争对手。只有说服你的竞争对手，才有可能最终通过审稿而发表。”这篇论文长达近2年的审稿也彰显了过程的曲折。

谢灿更愿意将科学界的这种争议称为学术辩论。“学术上的广泛争议和辩论，这本身就说明你研究的问题是非常重要的，这是显而易见的道理。”其次，谢灿认为，伴随着学术争议和辩论的进行，往往带来的是整个领域的飞速发展，“因为会有更多的，更严谨的实验被设计出来，去验证各自的观点。无论是证明还是证伪，我们越来越逼近科学的真相”

谢灿认为，动物磁感应领域之所以充满争议，“就是因为到目前为止没有任何一个假说或者模型是被所有人都公认的，每一个流派都有自己的支持者。”

类似此次的强强合作或能带来加速推进。“这是一个学科高度交叉融合的领域，如果想要在动物磁感应和生物导航领域做一些有趣的课题，很多时候都不可能依赖于一个实验室来完成。”谢灿表示。

许静静也同样提到，“解决一个科学问题，需要来自多个学科的共同努力，在我们团队中，各学科领域的专家拥有世界一流的技术，这对于促成了我们的研究至关重要。”她表示，在项目推进过程中，研究人员持续不断地沟通交流，理解不同学科领域的知识，以实现共同的科学目标。